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本试剂盒适用于快速提取植物组织细胞总RNA，基于无苯酚、氯仿RNA快速提取技术，增加了基因组DNA清除柱，可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过，吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成，世界上最简单快速的试剂盒。
  
• 植物RNA助提剂PlantAid可以有效结合多糖多酚，提高清除效果。
  
• 基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
  
• 世界领先适应性极其广泛，可以提取包括棉花、月季、拟南芥、杨树等数百种国内外试剂盒提取失败的样品。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值高达2.1～2.2，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 不合适的储存于低温（4℃或-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15～25℃）进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均可在室温完成（4℃离心也可以），使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。
  
• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!
  
• 需要自备乙醇，研钵(可选)。
  
• 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
  
• 裂解液RLT和RLTPlus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本试剂盒采用独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时注意以下几点。
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNaseI处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNaseI柱上消化处理。购买微量DNA柱式吸附清除试剂盒前可先索取具体操作说明书。
• 仔细阅读补充说明2，如果裂解液CLB效果好，可以联系我们单独订购裂解液CLB。以后可直接订购多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒。

• 直接研磨法：
  提取简单植物样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法。
  
  • 新鲜植物组织称重后取100mg～200mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg～200mg放入研钵），加入10体积（1mL）RLT和1体积（100μL） PLANTaid室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
    
    • PLANTaid是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分。
  • 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5～10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。
    
  • 取480μL裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
    
  • 立刻接操作步骤的步骤3。
• 液氮研磨法：
  提取复杂，易降解样品时推荐此法。
  
  • 取500μL裂解液RLT，转入1.5mL离心管中，加入50μL PLANTaid混匀备用。
    
  • 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg～100mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
    
  • 用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
    
  • 将裂解物13000rpm离心5～10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。
    
  • 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
    
  • 立刻接操作步骤的步骤3。
    
    • 以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1mL的裂解液RLT和100μL PLANTaid和100mg～200mg的样品。
• 将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13000rpm离心2分钟，弃掉废液。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2mL离心管内（不用RNAsefree或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μL裂解液RLTPlus，13000rpm离心30秒，收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450～500μL左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 立刻将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心2分钟，弃掉废液。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water（事先在70～90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果预期RNA产量>30μg，加30～50μL RNase-free water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

• 一般植物种类非常复杂，不同的植物种类和部位的样品使用本试剂盒效果不同。部分的样品在经过基因组DNA清除柱清除残留DNA的同时可能会严重降低产量。该种情况下，建议客户可以尝试按照植物RNA快速提取试剂盒(货号：ALH034)的操作步骤进行提取。略去基因组DNA清除柱子的步骤。ALH034和本试剂盒相比少一个基因组DNA清除柱的步骤，部分情况下可能会提高产量。如果ALH034提高产量的同时DNA残留也增多的情况下，客户可以根据实验需要加一个DNA酶柱上消化的步骤（微量DNA柱式吸附清除试剂盒）来清除残留DNA或者用传统的DNA酶消化来清除DNA残留。
  
• 关于特别复杂难提取植物样品提取失败或者产量低的情况：
  一些特别复杂的植物样品提取，如水稻种子，葡萄果实，蓝靛果果实，百合鳞茎，土豆块茎等，本试剂盒裂解液RLT无法提取，需选择多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒(货号：ALH038)。一些样品产量较低，也可以尝试ALH038。ALH038采用强力裂解液CLB选项，在很多情况下，可以提取复杂样品或者明显提高产量。本试剂盒目前赠送8mL裂解液CLB，您可以测试提取您样品的效果(附录2)。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!
  
• 取1mL裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65℃水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5%β-巯基乙醇（1mL CLB加50μL β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65℃水浴中预热。

• 液氮中研磨新鲜或-70℃冷冻的材料至细粉。
  
• 转移100mg～200mg细粉（水分少的样品如种子叶片等可加100mg～150mg，水分多的样品如西瓜可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中，立即激烈涡旋30～60秒或者用吸头吹打混匀裂解，短时放回65℃水浴中（5min～10min，时间稍长一点10分钟产量可能提高一些），中间偶尔颠倒1～2次帮助裂解。
  
  • ?-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10～20%。
• 振荡混匀后室温13000rpm离心10分钟。
  
• 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
  • 若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。
• 立刻接操作步骤的步骤3。